--ProTein--

Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda dapat ditemukan dalam satu sel. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari rangkaian dasar yang sama dari 20 jenis asam amino yang berikatan kovalen dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masing-masing individu, kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur protein. Yang paling istimewa adalah bahwa sel dapat merangkai ke-20 asam amino dalam berbagai kombinasi dan urutan, menghasilkan peptida dan protein yang mempunyai sifat-sifat dan aktivitas berbeda. Dari unit pembangun ini organisme yang berbeda dapat membuat produk-produk yang demikian bervariasi, seperti enzim, hormon, lensa protein pada mata, bulu ayam, jaring laba-laba, dan sebagainya (Lehninger, 1982).

Protein yang ditemukan kadang-kadang berkonjugasi dengan makromolekul atau mikromolekul seperti lipid, polisakarida dan mungkion fosfat. Protein terkonjugasi yang dikenal antara lain numleoprotein, fosfoprotein, metaloprotein, lipoprotein, flavoprotein dan glikoprotein. Protein yang diperlukan organisme dapat diklasifikasikan menjadi dua golongan utama ialah pertama protein sederhana yaitu protein yang apabila terhidrolisis hanya menghasilkan asam amino dan kedua protein terkonjugasi, yaitu

protein yang hidrolisis tidak hanya menghasilkan asam amino tetapi menghasilkan juga komponen anorganik yang disebut ”gugus prostetic” (Sumarno, 2002).

Langkah awal dalam pemurnian protein ialah menentukan bahan alam yang akan diproses. Penentuan ini didasarkan pada kadar protein yang ada di dalamnya. Tentu saja dipilih bahan alam yang mempunyai kadar protein yang tinggi dan mudah diperoleh. Analisis terhadap kadar protein dalam bahan alam tersebut perlu dilakukan untuk memperoleh data tentang kadar protein yang akan dimurnikan. Bila protein yang diinginkan tahan terhadap panas, cmpuran protein dapat dipanaskan sebentar untuk mengendapkan protein lain yang diinginkan. Di samping itu protein juga sensitif terhadap asam dan basa dengan konsentrasi tinggi, dan biasanya pemurnian protein dilakukan pada pH mendekati netral dengan menggunakan buffer tertentu. Setelah diperoleh larutan yang berisi beberapa macam protein maka proses selanjutnya ialah fraksionasi, yaitu memisahkan masing-masing protein dalam campuran secara fraksi demi fraksi. Dua cara yang biasa digunakan untuk proses fraksionasi ini yaitu pengendapan dan kromatografi (Poedjiadi,1994).

Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode yang mana bergantung dari jenis sample dan ketersediaan alat serta bahan. Metode yang umum digunakan adalah metode Kjeldahl, Lowry dan Biuret (Patong, 2007).

Metode yang juga digunakan adalah metode Lowry. Pada metode ini protein dengan asam fosfotungstat-fofomolibdat pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein yang tertera. Konsentrasi protein yang diukur berdasarkan optikal density pada panjang gelombang 600 nm (OD terpilih). Untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan, lebih dahulu dibuat kurva standar yang melukiskan hubungan antara Bovine Serum Albumin (BSA) atau albumin serum darah sapi. Larutan Lowry ada dua macam yaitu larutan A yang terdiri dari fosfotungstat-fosfomolibdat (1:1) dan larutan Lowry B yang terdiri dari Na-karbonat 2% dalam NaOH 0,1 N, kupri sulfat dan Na-K-Tartrat 2%. Cara penentuannya adalah 1 mL larutan protein ditambah 5 mL Lowry B, dokocok dan dobiarkan selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 0,5 mL Lowry A, dikocok dan dibiarkan 20 menit, selanjutnya diamati OD-nya pada panjang gelombang 600 nm. Cara Lowry ini 10-20 kali lebih sensitif daripada cara UV atau cara Biuret (Sudarmadji, dkk., 1996).

Beberapa metode yang juga sering digunakan antara lain (Sudarmadji, dkk., 1996):

1.Metode spektrofotometer UV

Kebanyakan protein mengabsorsi sinar ultraviolet maksimum pada 280 nm. Hal ini terutama untuk mengidentifikasi adanya asam amino tirosin, triptophan dan fenilalanin yang ada pada protein tersebut. Pengukuran protein berdasarkan absorpsi sinar UV adalah cepat, mudah dan tidak merusak bahan. Untuk keperluan perhitungan digunakan pula kurva standar.

2.Metode turbidimetri atau kekeruhan

Metode ini didasarkan pada kekeruhan yang terbentuk pada larutan yang mengandung protein apabila ditambahkan bahan pengendap protein misalnya Tri Chloro Acetic acid (TCA), kalium ferri sianida [K4Fe(CN)6] atau asam sulfosalisilat. Tingkat kekeruhan diukur dengan alat turbidimeter. Cara ini hanya dapat dipakai untuk bahan protein yang berupa larutan dan hasilnya biasanya kurang tepat.

3.Metode pengecatan

Beberapa bahan pewarna misalnya orange G. Orange 12 dan Amido Black dapat membentuk senyawaan berwarna dengan protein dan menjadi tidak larut. Dengan mengukur sisa bahan pewarna yang tidak bereaksi dalam larutan (dengan kolorimeter), maka jumlah protein dapat ditentukan dengan cepat.

4.Penentuan protein dengan titrasi formal

Larutan protein dinetralkan dengan basa (naOH), kemudian ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam (gugus karboksil) dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah PP, akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik. Titrasi formol ini hanya tepat untuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan protein dan kurang tepat untuk penentuan protein.